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方法介绍

蛋白质组学使用高通量的检测技术对细胞、组织或生物体表达的全部蛋白进行定性和定量分析。根据研究目的与研究深度的不同，蛋白质组学研究分为以下几个层次：

1、蛋白鉴定和序列验证（定性分析）：使用质谱和其他生化技术对样品中蛋白质的种类及其氨基酸序列进行分析、鉴定和验证；

2、蛋白定量分析（丰度分析）：对同一个样本中或不同样本间（如：野生型 vs. 突变体或者对照组 vs.处理组）蛋白表达的相对丰度或绝对含量进行分析；

3、蛋白翻译后修饰位点鉴定：对蛋白翻译后修饰的种类和修饰位点进行分析和鉴定；

4、蛋白互作体鉴定：使用 Co-IP、蛋白交联等技术，结合质谱技术鉴定蛋白复合体。

基于质谱的蛋白质组学研究包括“自上而下”（top-down）和“自下而上”（bottom-up）两条技术路线。Top-down 路线使用质谱分析完整蛋白质，获得其质荷比信息并计算蛋白质的分子量。完整蛋白离子在质谱仪中发生碰撞诱导碎裂，通过分析蛋白碎片的质荷比，进一步确定蛋白碎片的分子量和氨基酸序列，最终将蛋白片段的序列信息拼接成完整蛋白质的序列信息。Top-down 路线需要富集和纯化完整蛋白质，主要用于研究蛋白翻译后修饰和蛋白复合体等，对于水溶性较差的膜蛋白和低丰度蛋白的检测较为困难。在测定分子量较大的蛋白质时，对质谱仪的质量扫描范围、灵敏度和分辨率也有较高要求。Top-down 实验通常需要使用超高分辨的轨道阱质谱仪或 FT-ICR （傅里叶变换-离子自旋共振）质谱仪。

Bottom-up 技术路线无需预先分离和纯化蛋白质，而是使用特异性蛋白内切酶将蛋白酶解成一系列多肽片段。然后，使用液相色谱分离多肽混合物，再使用质谱测定这些多肽离子的质荷比，将多肽离子碎裂成碎片离子，并采集多肽碎片离子的二级质谱图。最后使用数据库搜索软件对多肽的二级质谱图进行氨基酸序列匹配和蛋白鉴定。获得蛋白质序列信息后，还可以对蛋白的翻译后修饰位点、表达量等进行进一步分析。

Bottom-up 路线使用蛋白内切酶将复杂蛋白混合物酶解成多肽片段，就像用霰弹枪（shot-gun）将蛋白击碎，因此自下而上的蛋白质组学技术路线又被称为 shot-gun proteomics（鸟枪法、霰弹法）。Bottom-up 法可以直接分析复杂的蛋白混合物，免除蛋白纯化过程，样品处理流程更简单。将蛋白酶解成肽段后再进行分析，还解决了膜蛋白水溶性差、难于提取和处理的问题。难溶于水的膜蛋白经过蛋白酶水解后，得到的多肽片段通常都具有较好的水溶性，便于后续的色谱分离和质谱鉴定。蛋白酶解后得到的多肽片段分子量通常小于 3 kDa，非常适于使用质谱测定其质荷比。如果质谱鉴定到的多肽的氨基酸序列是某个蛋白质特有的氨基酸序列，就可以确认样品中存在该蛋白质，而无需鉴定该蛋白质的全部氨基酸序列。“鸟枪法”技术路线是目前蛋白质组学研究中最常用的技术路线。 

“鸟枪法” 蛋白质组学实验流程

1、蛋白提取：使用蛋白裂解液、尿素等将目标蛋白从细胞、组织或生物体中提取出来，可使用丙酮沉淀等方法对提取的蛋白进行净化。进一步，可使用免疫沉淀等方法富集目标蛋白。

2、蛋白酶解：使用特异性蛋白内切酶对目标蛋白进行酶解，最常用的是胰蛋白酶，根据实际情况，可选择 Lys-C、Chymotrypsin、Asp-N 等蛋白酶；

3、色谱分离和质谱检测：使用纳升液相色谱对多肽进行分离，多肽按照疏水性由弱到强的顺序从色谱柱上依次洗脱。使用高分辨质谱对多肽的分子量和二级碎片进行检测；

4、数据分析：使用数据库搜索软件对质谱采集的数据进行蛋白序列匹配和蛋白定量。常用的数据库搜索软件包括：Mascot，Maxquant，Peaks，pFind，Spectronaut，DIA-NN 等。

蛋白质组学实验流程示意图

Cox & Mann, Annu. Rev. Biochem. 2011 80 273

简单的蛋白质组学实验可以鉴定 SDS-PAGE 条带中的“目标”蛋白条带是否符合预期、鉴定 Co-IP 实验发现的互作蛋白、确定蛋白翻译后修饰位点。复杂的蛋白质组学实验则可以对几十个甚至成百上千个细胞、组织或临床样品进行深度蛋白质组分析，对其中超过一万种蛋白质的表达量进行分析和比较，寻找不同生理状态下或不同疾病的细胞/组织中蛋白表达的差异，为研究植物响应逆境胁迫的生理机制、疾病的致病机理、药物的治疗机理等提供重要线索。

送样要求

SDS-PAGE 条带（考染或银染），需有肉眼可见的清晰条带；制胶过程中要严格控制角蛋白污染。

蛋白溶液，需明确标注蛋白的浓度和使用缓冲液的组成和浓度，不得含有SDS、RIPA、NP-40、CHAPS 和 Triton 等表面活性剂。若蛋白溶液含有表面活性剂，请提前联系生物质谱室工作人员，获取 FASP 酶解膜（10 kDa cut off 超滤膜）进行清洗和溶剂置换，彻底去除表面活性剂后，方可送样分析。

抗体磁珠（Magnetic Beads），beads悬浮液不得含有 SDS、Triton、NP-40 等表面活性剂。

大规模定量蛋白质组学实验：植物材料需要 1 g 及以上；细胞需要1×10⁶个细胞；动物组织需要 10 mg 以上。

蛋白翻译后修饰位点鉴定通常需要对修饰后的蛋白或者肽段进行富集，需要使用富集（抗体）小柱，送样前请联系生物质谱实验室确认。

注：如需使用胰蛋白酶之外的特殊蛋白酶，送样前请联系生物质谱实验室确认。

实验结果

生物质谱实验室会将实验结果以电子邮件形式发送到用户注册的邮箱中，实验原始数据在质谱实验室服务器上保留一年，用户在发表文章时如果需要上传原始（下机）数据，请联系生物质谱实验室工作人员拷贝。